ایمونوفلورسانس روشی برای جستجوی یک آنتی ژن یا یک آنتی بادی و تعیین موقعیت آن ها در یک برش بافتی یا سلول است . این روش برای جستجوی آنتی بادی ها واتو آنتی بادی ها در برابر عوامل عفونی، آنتی ژن های سلولی و بافتی استفاده می گردد.
روش ایمونوفلورسانس به دو روش انجام می شود:
مستقیم وغیر مستقیم.
هر دو روش مستقیم (Direct immunofluorescense) و غیر مستقیم (Indirect immunofluorescense) برپایه اتصال اختصاصی آنتی ژن - آنتی بادی استوار است. در ایمونوفلورسانس مستقیم تنها از یک آنتی بادی که به مواد فلوروسنت متصل شده است، استفاده می گردد و در روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم از دو آنتی بادی استفاده می شود که آنتی بادی ثانویه به مواد فلوروسنت اتصال یافته است.
در ایمونو فلورسانس مستقیم که بر روی بافت بیوپسی شده انجام میگردد، حصور کلاس های مختلف آنتی بادی مانند IgG ، IgM و IgA و نیز اجزای کمپلمان (مانند C3،C4) جستجو می گردند ولی در ایمونوفلورسانس غیرمستقیم نمونه سرم بیمار جهت بررسی حضور یا عدم حضور ( و هم چنین تیتراسیون) آنتی بادی ها و اتو آنتی بادی ها استفاده می گردد.
در روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم، سلولها یا بافت های گوناگون به عنوان آنتی ژن روی سطح اسلایدها پوشاندهشده اند، سرم بیمار روی چاهک های ایجاد شده روی این اسلایدها اضافه شده و بعد از طی انکوباسیون لازم و شستشو، آنتی بادی ضد آنتی بادی انسانی نشاندار با مواد فلورسنت مانند FITC اضافه میشود. در کنار سرم بیمار روی هر اسلاید یک کنترل منفی و یک کنترل مثبت نیز قرار داده می شود. در صورت وجود این آنتی بادی در سرم فرد به آنتی ژن موجود در اسلاید متصل شده و سپس این کمپلکس توسط آنتی بادی ثانویه کنژوگه با ماده فلوروسنت شناسایی شده که با میکروسکوپ فلوروسنت قابل مشاهده می باشد. با بررسی نمونه ها زیر میکروسکوپ فلورسنت و مقایسه الگوی فلورسنتی با الگوی حاصله از کنترل منفی وکنترل مثبت و الگو های موجود در منابع علمی تیتر و الگوی آنتی بادی هایی که بر علیه آنتی ژن تولید شده اند، مشخص می نمایند.
آزمایشگاه پاتوبیولوژی فرزان با در اختیار داشتن بهترین تجهیزات لازم برای انجام تکنیک IFA، طیف وسیعی از تستهای مورد نظر پزشکان محترم را به روش IFAبا دقت و اختصاصیت انجام می دهد. از جمله تستهایی که بااین روش در آزمایشگاه فرزان انجام میشود، می توان به موارد زیر اشاره نمود:
(Anti Nuclear Antibody (ANA
Anti-double stranded DNA (Anti-dsDNA) antibodies
همچنین آزمایشگاه فرزان مفتخر است تست تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای خود ایمنی روماتیسمی را به صورت مولتیپلکس انجام دهد که این تست شامل CENP-B,SS-B,RNP-Sm,Sm,Scl-70,dsDNA,SS-A52,SS-A60است.
دارای عملکرد اثبات شده در بیماران تحت درمان با داروهای سرکوب کننده ایمنی تست های تخصصی مولکولی با پانل های کاملا تخصصی در آرمایشگاه فرزان انجام می شود این پانل ها شامل:
ایمنوگلوبولین ها (IgG ,IgA ,IgM,IgE )
توصیف:
ایمنوگلوبولین ها آنتی بادی های سرم هستند که توسط پلاسماسل ها تولید می شوند و جزء مهم پاسخ ایمنی همورال می باشند. اندازه گیری ایزوتایپ های مختلف ایمنوگلوبولین های سرم ممکن است در انواع نقص ایمنی، عفونت ها، آلرژیک و بیمارهای لنفوپرولیفراتیو مفید باشند.
روش:
ایمنوگلوبولین های سرم به طور رایج به وسیله روش های ایمونولوژیک مخصوص مثل ELISA اندازه گیری می شوند.
مقادیر طبیعی:
غلظت ها ممکن است بر حسب آزمایشگاه و روش های مخصوص که استفاده می شود مختصر تفاوتی داشته باشد . اما در کل مقادیر نرمال ایمنوگلوبولین های سرم در بزرگسالان سالم به این ترتیب می باشد.
IgG: 550-1900 mg/dl
IgM: 50-150 mg/dl
IgA: 60-350 mg/dl
IgE به طور معمول به مقادیر خیلی کمتری وجود دارد.
غلظت ایمنوگلوبولین های سرم به میزان رشد ، ژنتیک و فاکتورهای محیطی بستگی دارد و در این بیان آنچه از همه مهمتر است سن می باشد.
:IgG ساخته شده توسط مادر از جفت عبور می کند که شروع آن از سه ماهه اول رشد جنین می باشد.
در موقع تولد، این سهم مادر از IgG قطع می شود و سطح IgG کل به آهستگی کاهش پید امیکند تا اینکه در 6-4 ماهگی IgG مربوطه که توسط نوزاد ساخته میشود افزایش می یابد.
سطح ایمنوگلوبولین ها در کودکی افزایش پیدا می کند و معمولاً در سن 12 سالگی به غلظت بزرگسالان می رسد.
مقادیر غیر طبیعی: مقادیر بر حسب وضعیت بالینی ، درمانی و ایزوتایپ متنوع هستند.
IgE: به خاطر غلظت خیلی کم IgE در افراد نرمال( که ممکن است غلظت سرمی اصلاً IgE قابل اندازه گیری نباشد ) در روش های متداول سنجش به آن اهمیتی نمی دهند.
غلظت IgE سرم مرتبط با وضعیت آلرژیک از قبیل رینیت آلرژیک ، آسم، بیماری آتوپیک پوست ، شوک آنافیلاکسی و بعضی از آلودگی های انگلی افزایش پیدا می کند. به هر حال تعیین IgE ویژه برای آنتی ژن مخصوص در ارزیابی بیماران با بیماری آلرژیک نسبت به اندازه گیری IgE کل از اهمیت بیشتری برخوردار است.
آنتی ژن ویژه IgE Antigen-specific با تست های In vivo مثل تست خراش پوستی که برای آلرژن ها به طور ویژه استفاده می شود ، و یا به وسیله روش in vitro مثل تست radioallergosorbent مشخص گردد.
IgM: IgM به طور معمول به صورت مولکول های بزرگ و سنگین پنتامتر در گردش خون می باشد. وتماماً در عروق باقی می ماند و از جفت عبور نمی کند.
در جواب چالش آنتی ژن، این ایمنوگلوبولین ها سریع تر ساخته می شوند. کاهش سطح IgM ممکن است در عفونت های مختلف یا اختلالات اتوایمیون که در آن تحریک پلی کلونال صورت می گیرد، افزایش مونوکلونال IgM در نئوپلاسم های پرولیفراتیو سلول های B ،ماکروگلوبونیمی والدن اشتروم دیده می شود. به خاطر اندازه بزرگ آنها مولکولهای، IgM تجمع پیدا میکنند و بر ویسکوزیته پلاسما تاثیر می گذارد و باعث نشانه های کلینیکی بیشتری نسبت به سایر ایزوتایپ های ایمنوگلوبولین می شود. آنتی بادی هایی IgM که از نظر کلینیکی مهم هستند فاکتور روماتوئید و گروه های خونی ABO عمل می کنند.
IgA : غلظت سرمی IgA بازتاب دو ایزوتایپ می باشد: IgA 1و IgA 2 اگر چه اینها تقریباً به طور مساوی در سرم وجود دارند. IgA 1 ایزوتایپ اصلی IgA است که در سطوح مخاطی ترشح می شود. این ترشح جزء مهم پاسخ ایمنی به پاتوژن هایی است که در سطوح مخاطی حضور دارند. سطوح IgA سرم، ممکن است وضع عملکردی پاسخ مرتبط به IgA را منعکس نکند. حقیقتاً غلظت سرمی IgA پایین تر از کمترین حد نرمال که شایعترین اختلال هومورال سیستم ایمنی است، در یک از هر 700 نفر دیده می شود. اگر چه تعداد زیادی از بیماران بدون علامت هستند، کاهش سطح سرمی IgA ممکن است در افراد نقص ایمنی دیده شود مثل افراد با انواع CVID.
IgG: تقریباً به یک اندازه در فضای داخل عروقی وخارج عروقی وجود دارد و قریب به 80% ایمنوگلوبولین در گردش را شامل می شود و مهمترین ایزوتایپ ایمنوگلوبولین در پاسخ ثانویه ایمنی می باشد. کل IgG سرم نماینده چهار زیر مجموعه (IgG 4, IgG 3 ,IgG 2, IgG11) می باشد. که به ترتیب کاهش غلظتشان در سرم نرمال ترتیب بندی شده اند. بنابراین کاهش ایزوله IgG1 بصورت کاهش IgG کل ( همچنین به صورت کاهش جزء گاما در الکتروفورز پروتئین های سرم) تظاهر میکند. به عکس ممکن است کمبود اجزاء IgG 4, IgG 3 با سطح نرمال IgG کل ماسکه شود.
فاکتورهای مخدوش کننده:
گذاشتن نمونه در دمای اتاق برای ساعت ها ممکن است ایمونوگلوبولین را کمتر نشان بدهد. رادیو تراپی، کموتراپی، و دوزهای زیاد کورتیکواستروئید نیز ممکن است سطوح پایین تر ایمونوگلوبولین را نشان دهد.
موارد استفاده:
تعیین مقدار کمی ایمونوگلوبولین سرم IgG ,IgA ,IgM برای ارزیابی ابتدایی بیمار با شک به نقص ایمنی هومورال، مناسب است. اگر این مقدار نرمال باشد و شک قوی به نقص ایمنی همورال داشته باشیم ممکن است لازم شود که ساب کلاس های IgG یا تیترهای آنتی ژن مشخص گردد. برای مثال تیترهای سرمی آنتی بادی ضد پنوموکوک در بیماری که به طور اختصاصی واکسینه شده است.
همینطور این تست در تشخیص بعضی پاراپروتئینمیها مثل مولتپل میلوما و بیماری ماکروگلوبولینیمیای والدن اشتروم استفاده می شود.
روش ایمونوفلورسانس به دو روش انجام می شود:
مستقیم وغیر مستقیم.
هر دو روش مستقیم (Direct immunofluorescense) و غیر مستقیم (Indirect immunofluorescense) برپایه اتصال اختصاصی آنتی ژن - آنتی بادی استوار است. در ایمونوفلورسانس مستقیم تنها از یک آنتی بادی که به مواد فلوروسنت متصل شده است، استفاده می گردد و در روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم از دو آنتی بادی استفاده می شود که آنتی بادی ثانویه به مواد فلوروسنت اتصال یافته است.
در ایمونو فلورسانس مستقیم که بر روی بافت بیوپسی شده انجام میگردد، حصور کلاس های مختلف آنتی بادی مانند IgG ، IgM و IgA و نیز اجزای کمپلمان (مانند C3،C4) جستجو می گردند ولی در ایمونوفلورسانس غیرمستقیم نمونه سرم بیمار جهت بررسی حضور یا عدم حضور ( و هم چنین تیتراسیون) آنتی بادی ها و اتو آنتی بادی ها استفاده می گردد.
در روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم، سلولها یا بافت های گوناگون به عنوان آنتی ژن روی سطح اسلایدها پوشاندهشده اند، سرم بیمار روی چاهک های ایجاد شده روی این اسلایدها اضافه شده و بعد از طی انکوباسیون لازم و شستشو، آنتی بادی ضد آنتی بادی انسانی نشاندار با مواد فلورسنت مانند FITC اضافه میشود. در کنار سرم بیمار روی هر اسلاید یک کنترل منفی و یک کنترل مثبت نیز قرار داده می شود. در صورت وجود این آنتی بادی در سرم فرد به آنتی ژن موجود در اسلاید متصل شده و سپس این کمپلکس توسط آنتی بادی ثانویه کنژوگه با ماده فلوروسنت شناسایی شده که با میکروسکوپ فلوروسنت قابل مشاهده می باشد. با بررسی نمونه ها زیر میکروسکوپ فلورسنت و مقایسه الگوی فلورسنتی با الگوی حاصله از کنترل منفی وکنترل مثبت و الگو های موجود در منابع علمی تیتر و الگوی آنتی بادی هایی که بر علیه آنتی ژن تولید شده اند، مشخص می نمایند.
آزمایشگاه پاتوبیولوژی فرزان با در اختیار داشتن بهترین تجهیزات لازم برای انجام تکنیک IFA، طیف وسیعی از تستهای مورد نظر پزشکان محترم را به روش IFAبا دقت و اختصاصیت انجام می دهد. از جمله تستهایی که بااین روش در آزمایشگاه فرزان انجام میشود، می توان به موارد زیر اشاره نمود:
(Anti Nuclear Antibody (ANA
Anti-double stranded DNA (Anti-dsDNA) antibodies
همچنین آزمایشگاه فرزان مفتخر است تست تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای خود ایمنی روماتیسمی را به صورت مولتیپلکس انجام دهد که این تست شامل CENP-B,SS-B,RNP-Sm,Sm,Scl-70,dsDNA,SS-A52,SS-A60است.
دارای عملکرد اثبات شده در بیماران تحت درمان با داروهای سرکوب کننده ایمنی تست های تخصصی مولکولی با پانل های کاملا تخصصی در آرمایشگاه فرزان انجام می شود این پانل ها شامل:
ایمنوگلوبولین ها (IgG ,IgA ,IgM,IgE )
توصیف:
ایمنوگلوبولین ها آنتی بادی های سرم هستند که توسط پلاسماسل ها تولید می شوند و جزء مهم پاسخ ایمنی همورال می باشند. اندازه گیری ایزوتایپ های مختلف ایمنوگلوبولین های سرم ممکن است در انواع نقص ایمنی، عفونت ها، آلرژیک و بیمارهای لنفوپرولیفراتیو مفید باشند.
روش:
ایمنوگلوبولین های سرم به طور رایج به وسیله روش های ایمونولوژیک مخصوص مثل ELISA اندازه گیری می شوند.
مقادیر طبیعی:
غلظت ها ممکن است بر حسب آزمایشگاه و روش های مخصوص که استفاده می شود مختصر تفاوتی داشته باشد . اما در کل مقادیر نرمال ایمنوگلوبولین های سرم در بزرگسالان سالم به این ترتیب می باشد.
IgG: 550-1900 mg/dl
IgM: 50-150 mg/dl
IgA: 60-350 mg/dl
IgE به طور معمول به مقادیر خیلی کمتری وجود دارد.
غلظت ایمنوگلوبولین های سرم به میزان رشد ، ژنتیک و فاکتورهای محیطی بستگی دارد و در این بیان آنچه از همه مهمتر است سن می باشد.
:IgG ساخته شده توسط مادر از جفت عبور می کند که شروع آن از سه ماهه اول رشد جنین می باشد.
در موقع تولد، این سهم مادر از IgG قطع می شود و سطح IgG کل به آهستگی کاهش پید امیکند تا اینکه در 6-4 ماهگی IgG مربوطه که توسط نوزاد ساخته میشود افزایش می یابد.
سطح ایمنوگلوبولین ها در کودکی افزایش پیدا می کند و معمولاً در سن 12 سالگی به غلظت بزرگسالان می رسد.
مقادیر غیر طبیعی: مقادیر بر حسب وضعیت بالینی ، درمانی و ایزوتایپ متنوع هستند.
IgE: به خاطر غلظت خیلی کم IgE در افراد نرمال( که ممکن است غلظت سرمی اصلاً IgE قابل اندازه گیری نباشد ) در روش های متداول سنجش به آن اهمیتی نمی دهند.
غلظت IgE سرم مرتبط با وضعیت آلرژیک از قبیل رینیت آلرژیک ، آسم، بیماری آتوپیک پوست ، شوک آنافیلاکسی و بعضی از آلودگی های انگلی افزایش پیدا می کند. به هر حال تعیین IgE ویژه برای آنتی ژن مخصوص در ارزیابی بیماران با بیماری آلرژیک نسبت به اندازه گیری IgE کل از اهمیت بیشتری برخوردار است.
آنتی ژن ویژه IgE Antigen-specific با تست های In vivo مثل تست خراش پوستی که برای آلرژن ها به طور ویژه استفاده می شود ، و یا به وسیله روش in vitro مثل تست radioallergosorbent مشخص گردد.
IgM: IgM به طور معمول به صورت مولکول های بزرگ و سنگین پنتامتر در گردش خون می باشد. وتماماً در عروق باقی می ماند و از جفت عبور نمی کند.
در جواب چالش آنتی ژن، این ایمنوگلوبولین ها سریع تر ساخته می شوند. کاهش سطح IgM ممکن است در عفونت های مختلف یا اختلالات اتوایمیون که در آن تحریک پلی کلونال صورت می گیرد، افزایش مونوکلونال IgM در نئوپلاسم های پرولیفراتیو سلول های B ،ماکروگلوبونیمی والدن اشتروم دیده می شود. به خاطر اندازه بزرگ آنها مولکولهای، IgM تجمع پیدا میکنند و بر ویسکوزیته پلاسما تاثیر می گذارد و باعث نشانه های کلینیکی بیشتری نسبت به سایر ایزوتایپ های ایمنوگلوبولین می شود. آنتی بادی هایی IgM که از نظر کلینیکی مهم هستند فاکتور روماتوئید و گروه های خونی ABO عمل می کنند.
IgA : غلظت سرمی IgA بازتاب دو ایزوتایپ می باشد: IgA 1و IgA 2 اگر چه اینها تقریباً به طور مساوی در سرم وجود دارند. IgA 1 ایزوتایپ اصلی IgA است که در سطوح مخاطی ترشح می شود. این ترشح جزء مهم پاسخ ایمنی به پاتوژن هایی است که در سطوح مخاطی حضور دارند. سطوح IgA سرم، ممکن است وضع عملکردی پاسخ مرتبط به IgA را منعکس نکند. حقیقتاً غلظت سرمی IgA پایین تر از کمترین حد نرمال که شایعترین اختلال هومورال سیستم ایمنی است، در یک از هر 700 نفر دیده می شود. اگر چه تعداد زیادی از بیماران بدون علامت هستند، کاهش سطح سرمی IgA ممکن است در افراد نقص ایمنی دیده شود مثل افراد با انواع CVID.
IgG: تقریباً به یک اندازه در فضای داخل عروقی وخارج عروقی وجود دارد و قریب به 80% ایمنوگلوبولین در گردش را شامل می شود و مهمترین ایزوتایپ ایمنوگلوبولین در پاسخ ثانویه ایمنی می باشد. کل IgG سرم نماینده چهار زیر مجموعه (IgG 4, IgG 3 ,IgG 2, IgG11) می باشد. که به ترتیب کاهش غلظتشان در سرم نرمال ترتیب بندی شده اند. بنابراین کاهش ایزوله IgG1 بصورت کاهش IgG کل ( همچنین به صورت کاهش جزء گاما در الکتروفورز پروتئین های سرم) تظاهر میکند. به عکس ممکن است کمبود اجزاء IgG 4, IgG 3 با سطح نرمال IgG کل ماسکه شود.
فاکتورهای مخدوش کننده:
گذاشتن نمونه در دمای اتاق برای ساعت ها ممکن است ایمونوگلوبولین را کمتر نشان بدهد. رادیو تراپی، کموتراپی، و دوزهای زیاد کورتیکواستروئید نیز ممکن است سطوح پایین تر ایمونوگلوبولین را نشان دهد.
موارد استفاده:
تعیین مقدار کمی ایمونوگلوبولین سرم IgG ,IgA ,IgM برای ارزیابی ابتدایی بیمار با شک به نقص ایمنی هومورال، مناسب است. اگر این مقدار نرمال باشد و شک قوی به نقص ایمنی همورال داشته باشیم ممکن است لازم شود که ساب کلاس های IgG یا تیترهای آنتی ژن مشخص گردد. برای مثال تیترهای سرمی آنتی بادی ضد پنوموکوک در بیماری که به طور اختصاصی واکسینه شده است.
همینطور این تست در تشخیص بعضی پاراپروتئینمیها مثل مولتپل میلوما و بیماری ماکروگلوبولینیمیای والدن اشتروم استفاده می شود.